圖片展示

熱門產品:瞬態光電壓/光電流系統 電緻發光測量系統  熒光光譜儀  吸收光譜儀  超快光譜系統   超分辨光譜系統  激光器   納米紅外光譜系統 

搜索
新聞資訊

聯系我們

 服務熱線

  
電話:020-66834066
售後:020-66834122
郵箱:service@orientalspectra.com
網址:www.orientalspectra.com

地 址:廣州市天河區長福路長興智彙商務中心

液相色譜的基本認識

作者:小官人 瀏覽: 發表時間:2020-06-05 09:00:00 來源:儀器信息網
一、基本原理


高效液相色譜(HPLC)法是以高壓下的液體為流動相,並采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。


高效液相色譜對樣品的適用性廣,不受分析對象揮發性和熱穩定性的限製,因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中,可用氣相色譜分析的約占20%,而80%則需用高效液相色譜來分析。 


高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同,它們之間的重大差別在於作為流動相的液體與氣體之間的性質的差別。   


二、高效液相色譜分析原理


(1) 高效液相色譜分析的流程:

由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統,然後輸出,經流量與壓力測量之後,導入進樣器。被測物由進樣器注入,並隨流動相通過色譜柱,在柱上進行分離後進入檢測器,檢測信號由數據處理設備采集與處理,並記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。

遇到複雜的混合物分離(極性範圍比較寬)還可用梯度控製器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜改變溫度,而HPLC改變的是流動相極性,使樣品各組分在最佳條件下得以分離。 


(2) 高效液相色譜的分離過程:

同其他色譜過程一樣,HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。 

開始樣品加在柱頭上,假設樣品中含有3個組分,A、B和C,隨流動相一起進入色譜柱,開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留,較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時間長,較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介於A,C之間,第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統,則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先後流出色譜柱,達到分離之目的。

不同組分在色譜過程中的分離情況,首先取決於各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異,這是熱力學平衡問題,也是分離的首要條件

其次,當不同組分在色譜柱中運動時,譜帶隨柱長展寬,分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。


三、工作原理


儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相) 內, 由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數, 在兩相中作相對運動時, 經過反複多次的吸附- 解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內流出, 通過檢測器時, 樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式打印出來。


四、HPLC的特點和優點


HPLC有以下特點:



高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。

高速——流速為0.1~10.0 ml/min。 

高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。


HPLC與經典液相色譜相比有以下優點:



速度快——通常分析一個樣品在15~30 min,有些樣品甚至在5 min內即可完成。 

分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng,熒光和電化學檢測器可達0.1pg。

柱子可反複使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。    

樣品量少,容易回收——樣品經過色譜柱後不被破壞,可以收集單一組分或做製備。


五、液相色譜的五大系統


1、進樣系統

進樣系統分為手動進樣閥和自動進樣器。


手動進樣閥

對於手動進樣閥,使用過程中需要注意每個樣品進樣完成後應對進樣閥進行清洗,防止殘留對下一個樣品分析的影響。


還需要注意進樣方式,以20μL定量環為例,我們可以選擇完全充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進樣的重複性,選擇完全充滿定量管進樣方式時,需要注入定量環體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進樣方式時,進樣體積應在定量管體積一半以下,即1-10μL。


自動進樣器

如果采用自動進樣器進樣,首先需要保證注射器裏面沒有氣泡存在,否則影響進樣量準確性;其次是樣品瓶裏面有足夠的樣品,保證進樣針能夠吸到樣品。


為了避免交叉汙染需要定期對樣品瓶、蓋和墊進行清洗。若自動進樣器長時間不使用,應該注意:腐蝕性的流動相或洗液(例如,堿性或酸性緩衝溶液)必須完全從系統中置換出來。同時,為了避免細菌的生長,應將一個樣品瓶中充滿甲醇,並重複幾次進樣操作。


2、輸液系統

輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵恒流泵。對液相色譜分析來說,輸液泵的流量穩定性更為重要,這是因為流速的變化會引起溶質的保留值的變化,而保留值是色譜定性的主要依據之一。因此,恒流泵的應用更廣泛。


輸液泵按工作方式分為氣動泵機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往複泵、雙活塞往複泵和往複式隔膜泵。


HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件:

a 流量恒定,無脈動,並有較大的調節範圍(一般為1~10ml/min);

b 能抗溶劑腐蝕;

c 有較高的輸液壓力;對一般分離,60×105Pa的壓力就滿足了,對高效分離,要求達到150~300×105Pa。


(1)往複式柱塞泵結構和原理

當柱塞推入缸體時,泵頭出口(上部)的單向閥打開,同時,流動相進入的單向閥(下部)關閉,這時就輸出少量的流體。


反之,當柱塞向外拉時,流動相入口的單向閥打開,出口的單向閥同時關閉,一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。


這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響,連續供給恒定體積的流動相。


(2)氣動放大泵結構和原理

其工作原理是:壓力為p1的低壓氣體推動大面積(SA )活塞A,則在小面積(SB )活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數取決於A和B兩活塞的面積比,如果A與B的面積之比為50:1 ,則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。


泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞杆。單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成。在壓力的作用下寶石球離開閥座,流動相流過單向閥;反之,在反向力的作用下,寶石球回到閥座上,此時流動相不再流過單向閥。


顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏。為了保證單向閥不發生泄漏,一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座,也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上。


在不同的應用領域,單向閥閥體的材料有所不同,例如考慮生物兼容性的系統,單向閥的閥體往往采用金屬鈦,而不用不鏽鋼。為了降低成本和減少維護費用,一些生產廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件,當然其功能仍保持不變。


輸液系統即是指高壓恒流泵,其作用是能提供穩定準確的流速。


溶劑過濾頭:吸液過濾頭,或稱沉子,主要作用是過濾流動相中可能存在的顆粒性雜質。長時間使用後,雜質有可能阻塞溶劑過濾頭上的過濾板孔隙;或長時間使用緩衝液,過濾頭表面容易產生一層膜,阻礙流動相正常通過。


嚴重時,即使是已超聲過的溶劑,泵吸液時也會有氣泡在四氟輸液管裏產生,因此應經常對過濾頭進行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液,正相系統需注意濾頭的烘幹處理。


單向閥:單向閥的作用是確保液體向一個方向流動,是高壓恒流泵穩定輸液的保證。日常使用過程中,可以通過觀察壓力的情況,初步判斷流量是否正常。


如果系統已經平衡一段時間,壓力應該是穩定的。但如果壓力存在波動,則表明流量不穩定;如果無壓力,則表明無流量。這兩種情況大多是因為單向閥裏混入了氣泡或雜質。


混入氣泡的情況,應把放空閥打開,按衝洗鍵將裏面的氣泡排出。單向閥混入雜質的情況,須對其進行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇,安裝時注意標記環的方向。


密封圈:密封圈是固定在柱塞杆上防止泵腔內的液體泄漏,是保證泵頭輸液正常的關鍵部件。但柱塞杆和柱塞密封圈長期使用會發生磨損,主要與流量、操作壓力和所使用的流動相有關。


當使用含鹽的流動相時,由於脫水或蒸發,可能形成鹽結晶,而泵運動時鹽結晶會導緻密封圈和柱塞杆的磨損。因此,每天實驗前和實驗後都需用純水衝洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二級密封圈之間),保持清洗管內有水以防止形成晶體,延長柱塞杆和密封圈的使用壽命。


在線過濾器:為了防止由於流動相雜質微粒進入色譜系統,泵在放空閥內安裝了在線過濾器,經泵出口流出的液體通過在線過濾器,經排空管流出的液體不通過在線過濾器。


儀器使用一定時間後,建議用戶清洗在線過濾器的燒結不鏽鋼過濾片。用扳手卸下壓帽,將密封環和燒結不鏽鋼過濾片一同取出清洗,清洗後按原位裝上。清洗溶劑可以選擇30%稀硝酸溶液,正相系統需注意濾頭的烘幹處理。


3、分離系統

分離系統包括色譜柱、保護柱以及柱溫箱。
色譜柱色譜柱是樣品分離的核心。色譜柱在使用前必須仔細閱讀說明書,了解色譜柱使用的pH值範圍、溶劑耐受範圍、壓力範圍和維護方法等事項。色譜柱使用完後,需及時對色譜柱進行衝洗。衝洗完成後,應該將色譜柱從儀器上拆下來,兩端用廠家配的堵頭密封後,保存在色譜柱盒裏。

保護柱:保護柱的作用主要是防止吸附性強的雜質對色譜柱汙染,從而延長色譜柱的壽命。針對不同型號的色譜柱,應選擇相對應填料的保護柱。應注意柱芯也是有壽命的,應該定期進行更換。

柱溫箱色譜柱溫度變化,可能會導緻保留時間的變化。為了避免這個問題,建議使用柱溫箱。


4、檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
(1)紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點是,使用面廣(如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)、靈敏度高(檢測下限為10-10 g/mL)、線性範圍寬、對溫度和流速變化不敏感、可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。目前,糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7 g/mL),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不適用於痕量分析,也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。

(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質,在一定條件下,其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此,這一檢測器隻適用於具有熒光的有機化合物(如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等)的測定,其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用。

HPLC常用的檢測器是紫外檢測器。在日常使用過程中紫外檢測器主要需要注意檢測池和氘燈的使用與維護。

檢測池:檢測池長時間使用可能會造成汙染,如果儀器的參比能量(REF ENERGY)正常,測量能量(SMPENERGY)偏低,可能為檢測池汙染導緻,可以對檢測池進行清洗。

對檢測池零件的進行清洗,一般先采用約1:4的硝酸溶液超聲清洗,分別用純水和甲醇溶液清洗,然後重新組裝並將檢測池池體推進池腔內,擰緊池板螺絲。注意組裝中,池玻璃及墊片一定要放正,以免壓碎池玻璃,造成檢測池泄漏。

氘燈:氘燈正常使用壽命可在1500小時以上。燈的使用壽命與檢測器的使用時間和開啟頻率有關,因此使用過程中應盡量節省不必要的開機時間,減少開關頻率,以延長氘燈的使用壽命。

如果準確地判斷出氘燈已經不能點亮或能量太低,則需要更換新的氘燈。在購買氘燈時,應注意谘詢和核對氘燈的型號與儀器型號是否匹配。更換到氘燈時,參照儀器說明書中的相關內容,特別要注意氘燈連接線的位置順序。


5、數據處理系統

該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、製備或鑒定工作能正確開展。


六、色譜法的常用基本術語


1、色譜圖(chromatogram)色譜柱流出物通過檢測器系統時所產生的響應信號對時間或流動相流出體積的曲線圖,或者通過適當的方法觀察到的紙色譜或薄層色譜斑點、譜帶的分布圖。
2、(色譜)峰(chromatographic peak)色譜柱流出組分通過檢測器系統時所產生的響應信號的微分曲線。
3、峰底(peak base)峰的起點與終點之間的連接的直線(圖1 中的CD)。
4、峰高(h, peak height)色譜峰最大值點到峰底的距離(圖1 中的BE)。
5、峰寬(W, peak width):在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點的距離。
6、半高峰寬(Wh/2, peak withd at half height)過峰高的中點作平行於峰底的直線,此直線與峰兩側相交兩點之間的距離(圖1 中的HJ)。
7、峰面積(A, peak area)峰與峰底之間的面積。
8、拖尾峰(tailing peak)後沿較前沿平緩的不對稱的峰。
9、前伸峰(leading peak)前沿較後沿平緩的不對稱的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)
10、假峰(ghost peak)除組分正常產生的色譜峰外,由於儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現的色譜峰,即並非由試樣所產生的峰。這種色譜峰並不代表具體某一組分,容易給定性、定量帶來誤差。(又叫鬼峰)
11、畸峰(distrorted peak)形狀不對稱的色譜峰,前伸峰、拖尾峰都屬於這類。
12、反峰(negative peak)稱倒峰、負峰,即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。
13、原點(origin):紙或薄層板上滴加試樣部位的中心點。
14、斑點(spot)面色譜法中,組分在展開和顯譜後呈現近似圓形或橢圓形的色區(圖2)。
15、區帶(zone)在色譜柱、紙或薄層板上被分離組分所占的區域。
16、複斑(multiple spot)一種組分展開後形成兩個或多個清晰斑點。
17、區帶拖尾(zone tailing)由於物理、化學等作用的影響,一種組分在展開後形成的彗星形狀斑點。
18、基線(base line)在正常操作條件下,僅有流動相通過檢測器系統時所產生的響應信號曲線。
19、基線漂移(baseline drift)基線隨時間定向的緩慢變化。
20、基線噪聲(N, baseline noise)由於各種原因而引起的基線波動。


七、應用領域


環境:常見無機陰陽離子、多環芳烴、多氯聯苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態、除草劑、 農藥、酸沉降成分。 
農業:土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農產品中無機和有機成分。
石油類族組成、石油中微量成分。 
化工無機化工產品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。
材料晶材料、合成高分子材料。 
食品無機陰陽離子、有機酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、黴菌毒素、多核芳烴。 
生物氨基酸、多肽、蛋白質、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。
醫藥體化學成分、各類合成藥物成分、各種天然植物和動物藥物化學成分。



儀器信息網| “儀器論壇”小官人


文章推薦

走進我們

在線留言

東譜科技(廣州)有限責任公司    Copyright 2020  粵ICP備18054769號   020-66834066 

在線谘詢

您好,請點擊在線客服進行在線溝通!

聯系方式
聯系電話
020-66834066(光電)
聯系電話
020-66834122(光譜)
掃一掃二維碼
二維碼
光電產品
二維碼
光譜產品
添加微信好友,詳細了解產品
使用企業微信
“掃一掃”加入群聊
複製成功
添加微信好友,詳細了解產品
我知道了