高效液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動相，並采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。

高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限製，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。 

高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在於作為流動相的液體與氣體之間的性質的差別。   

（1） 高效液相色譜分析的流程：

（2） 高效液相色譜的分離過程：

高壓——壓力可達150~300 Kg/cm²。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm²以上。

高速——流速為0.1~10.0 ml/min。 

高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。 

分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。

柱子可反複使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。    

樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做製備。

進樣系統分為手動進樣閥和自動進樣器。

手動進樣閥

對於手動進樣閥，使用過程中需要注意每個樣品進樣完成後應對進樣閥進行清洗，防止殘留對下一個樣品分析的影響。

還需要注意進樣方式，以20μL定量環為例，我們可以選擇完全充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進樣的重複性，選擇完全充滿定量管進樣方式時，需要注入定量環體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進樣方式時，進樣體積應在定量管體積一半以下，即1-10μL。

自動進樣器

如果采用自動進樣器進樣，首先需要保證注射器裏面沒有氣泡存在，否則影響進樣量準確性;其次是樣品瓶裏面有足夠的樣品，保證進樣針能夠吸到樣品。

為了避免交叉汙染需要定期對樣品瓶、蓋和墊進行清洗。若自動進樣器長時間不使用，應該注意：腐蝕性的流動相或洗液(例如，堿性或酸性緩衝溶液)必須完全從系統中置換出來。同時，為了避免細菌的生長，應將一個樣品瓶中充滿甲醇，並重複幾次進樣操作。

輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析來說，輸液泵的流量穩定性更為重要，這是因為流速的變化會引起溶質的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據之一。因此，恒流泵的應用更廣泛。

輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往複泵、雙活塞往複泵和往複式隔膜泵。

HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：

a 流量恒定，無脈動，並有較大的調節範圍（一般為1～10ml/min）；

b 能抗溶劑腐蝕；

c 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150～300×105Pa。

當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。

反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。

這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響，連續供給恒定體積的流動相。

其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積（SA ）活塞A，則在小面積（SB ）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數取決於A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。

泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞杆。單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成。在壓力的作用下寶石球離開閥座，流動相流過單向閥；反之，在反向力的作用下，寶石球回到閥座上，此時流動相不再流過單向閥。

顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏。為了保證單向閥不發生泄漏，一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座，也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上。

在不同的應用領域，單向閥閥體的材料有所不同，例如考慮生物兼容性的系統,單向閥的閥體往往采用金屬鈦，而不用不鏽鋼。為了降低成本和減少維護費用，一些生產廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件，當然其功能仍保持不變。

輸液系統即是指高壓恒流泵，其作用是能提供穩定準確的流速。

溶劑過濾頭：吸液過濾頭，或稱沉子，主要作用是過濾流動相中可能存在的顆粒性雜質。長時間使用後，雜質有可能阻塞溶劑過濾頭上的過濾板孔隙；或長時間使用緩衝液，過濾頭表面容易產生一層膜，阻礙流動相正常通過。

嚴重時，即使是已超聲過的溶劑，泵吸液時也會有氣泡在四氟輸液管裏產生，因此應經常對過濾頭進行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系統需注意濾頭的烘幹處理。

單向閥：單向閥的作用是確保液體向一個方向流動，是高壓恒流泵穩定輸液的保證。日常使用過程中，可以通過觀察壓力的情況，初步判斷流量是否正常。

如果系統已經平衡一段時間，壓力應該是穩定的。但如果壓力存在波動，則表明流量不穩定；如果無壓力，則表明無流量。這兩種情況大多是因為單向閥裏混入了氣泡或雜質。

混入氣泡的情況，應把放空閥打開，按衝洗鍵將裏面的氣泡排出。單向閥混入雜質的情況，須對其進行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇，安裝時注意標記環的方向。

密封圈：密封圈是固定在柱塞杆上防止泵腔內的液體泄漏，是保證泵頭輸液正常的關鍵部件。但柱塞杆和柱塞密封圈長期使用會發生磨損，主要與流量、操作壓力和所使用的流動相有關。

當使用含鹽的流動相時，由於脫水或蒸發，可能形成鹽結晶，而泵運動時鹽結晶會導緻密封圈和柱塞杆的磨損。因此，每天實驗前和實驗後都需用純水衝洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二級密封圈之間)，保持清洗管內有水以防止形成晶體，延長柱塞杆和密封圈的使用壽命。

在線過濾器：為了防止由於流動相雜質微粒進入色譜系統，泵在放空閥內安裝了在線過濾器，經泵出口流出的液體通過在線過濾器，經排空管流出的液體不通過在線過濾器。

儀器使用一定時間後，建議用戶清洗在線過濾器的燒結不鏽鋼過濾片。用扳手卸下壓帽，將密封環和燒結不鏽鋼過濾片一同取出清洗，清洗後按原位裝上。清洗溶劑可以選擇30%稀硝酸溶液，正相系統需注意濾頭的烘幹處理。

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